短乳杆菌鸟氨酸氨甲酰基转移酶对黄酒发酵中氨基甲酸乙酯的调控作用（一） 氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate

氨基甲酸乙酯（Ethylcarbamate，短乳对黄的调EC）是杆菌一种在动物乃至人体内具有潜在致癌性的2A类致癌物，存在于多种发酵食品及酒精饮料中，鸟氨如酱油、酸氨奶酪、甲酰基转酒发酵中甲酸葡萄酒、移酶乙酯用黄酒等。氨基研究表明，控作尿素、短乳对黄的调瓜氨酸、杆菌氨甲酰磷酸、鸟氨氰酸和焦碳酸二乙酸是酸氨EC形成的前体物，其中酵母菌和部分乳酸菌通过精氨酸代谢途径产生的甲酰基转酒发酵中甲酸尿素和瓜氨酸是最重要的2种前体物。

酒类的移酶乙酯用瓜氨酸主要自精氨酸脱亚胺酶途径代谢产生，在这一途径中包括3种关键酶，氨基分别为精氨酸脱亚胺酶（Argininedeimidase，ADＩ，EC3.5.3.6）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（Ornithinetranscarbamoylase，OTC，EC2.1.3.3）和氨基甲酸激酶（Carbamatekinase，CK，EC2.7.2.2）。该途径将精氨酸水解，最终转化为鸟氨酸、氨和二氧化碳。

目前关于鸟氨酸氨甲酰转移酶的研究较少，主要集中在人体内，由于是肝脏尿素循环的必需酶，因此OTC酶的缺失常导致嗜睡、呕吐、精神发育迟缓等症状，同时OTC的缺失与否也可作为肝细胞癌的早期诊断指标之一。根据之前的研究发现，OTC与氨基甲酸乙酯的形成呈负相关性，即OTC的表达对EC的形成有抑制作用，然而OTC与EC的直接关联性未见研究报道。

短乳杆菌是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌，在含碳水化合物的动物、植物发酵产品以及温血类动物的消化系统中十分常见，作为一般认为安全（Generallyrecognizedassafe，GRAS）的食品级微生物，在食品、工业、农牧业及医药等领域中亦拥有重要的应用价值。挖掘益生性乳酸菌源的酶类是目前人们的关注点之一。

本研究以短乳杆菌中的鸟氨酸氨甲酰基转移酶为对象，通过基因克隆表达手段和Ni-NTA纯化方法，获得大量高纯度的OTC酶，在黄酒发酵的不同阶段直接添加到酒体中，研究其与EC之间的相互作用，为挖掘其潜在的工业应用价值奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）和质粒pET28a由本实验室保存，大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21（DE3），全试金公司。细菌基因组提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Ni-NTA琼脂糖树脂、L-精氨酸、L-瓜氨酸、DL-鸟氨酸、茚三酮、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG）、硫酸卡那霉素（Kan），生工生物工程（上海）股份有限公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHＩ、SalＩ，TaKaRa公司；麦曲、酒药，浙江塔牌黄酒公司。

1.2 方法

1.2.1 鸟氨酸氨甲酰基转移酶的克隆

短乳杆菌OTC酶的正向引物序列为：5’-cgcggatccATGACTAAGGATTTTCGGGAAAATGTA-3’（下划线为BamHＩ识别序列），反向引物序列为：5’-acgcgtcgacTTAAGCTCGTGGAATGAATAAGTTACCT-3’（下划线为SalＩ识别序列）。以短乳杆菌的基因组DNA为模板进行基因扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后进行纯化。

1.2.2 重组表达质粒的构建

采用限制性内切酶BamHＩ和SalＩ分别对短乳杆菌OTC基因片段和载体pET-28a进行双酶切。酶切产物经试剂盒回收后，连接并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布在含卡那霉素的LB平板上，经菌落PCR验证后，筛选得到阳性克隆，并测序鉴定目的基因序列。

1.2.3 重组鸟氨酸氨甲酰基转移酶的诱导表达与分离纯化

挑取阳性单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200r/min振荡培养过夜。按1%（体积分数）接种量转接于200mL的LB培养基中，继续于37℃，200r/min振荡培养，至OD600nm达到0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（ＩPTG），于25℃，180r/min诱导培养过夜。离心收集菌体后，加入30mL缓冲液（50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/LＩmidazole，pH8.0）重悬菌体，随后冰水浴超声破碎细胞，于4℃，12000r/min离心20min，获得上清液。参照Ni-NTA琼脂糖树脂的使用说明方法，采用亲和层析纯化重组蛋白，随后利用SDSPAGE检测蛋白纯度及分子质量。

1.2.4 黄酒酿造过程及试验处理方法

以0.8kg糯米为原料，30℃下浸米2d，高温蒸煮后冷却，加入160g麦曲和1.6g酒药及0.96L水，搅拌均匀后于28℃发酵。以不作任何处理的自然发酵黄酒作为对照组（CK），在发酵第5天加入纯化后的鸟氨酸氨甲酰基转移酶（5D），在发酵第12天加入相同浓度的鸟氨酸氨甲酰基转移酶（12D），分析比较发酵过程中EC及其相关代谢物的差异。

1.2.5 氨基甲酸乙酯的HPLC-FLD测定

测定方法参照Fu等[3]的报道，样品与0.1mL，1.5mol/L盐酸和0.2mL，0.01mol/L占吨醇正丙醇溶液衍生后，通过高效液相色谱法检测。以甲醇和水作为流动相，荧光检测器激发波长233nm，发射波长600nm，梯度洗脱进样。

1.2.6 尿素、瓜氨酸和鸟氨酸氨甲酰基转移酶活的测定

尿素和瓜氨酸的检测方法分别参照陈宜宜等和Boyde等的文献所述，通过与显色剂的显色反应来检测发酵液中的含量。
取发酵液超声15min破碎细胞，于4℃，12000r/min离心20min，取上清为原蛋白提取物。根据茚三酮显色反应来测定OTC酶活，蛋白含量则采用Bradford法进行测定。本试验中OTC酶活定义为每分钟水解1mg蛋白质产生1μmol鸟氨酸所需要的酶量为1个酶活单位。

1.2.7 黄酒基础理化品质的检测分析

1.2.7.1 黄酒中游离氨基酸的含量测定

采用日本日立L-8900氨基酸分析仪进行测定。检测原理为采用茚三酮作为衍生剂与氨基酸衍生后检测分析。前处理方法为：取50mL黄酒样品，加0.1mol/L盐酸溶液超声振荡5min，加5%磺酸水杨酸去除蛋白，离心后采用氮吹仪浓缩，加0.02mol/L盐酸2mL，振荡后过膜，上机检测。

1.2.7.2 挥发性风味物质的检测

将8mL酒样和0.2gNaCl加入顶空瓶中，50℃下磁力搅拌加热15min后，将萃取头插入顶空瓶中，继续于50℃下加热30min后进样。GC色谱条件：载气为氮气，流速为1mL/min，无分流进样；程序升温：初始柱温40℃，保持5min，以5℃/mL的速率升温至230℃，保持10min。进样口温度250℃，GC解析时间2.5min。质谱条件：电子轰击离子源（EＩ）电子能量为70eV，离子源温度250℃，接口温度250℃，检测口电压为350V。扫描方式为全扫描，质量范围为35～350。

1.2.7.3 电子舌味觉分析

相对于感官鉴评方法，电子舌实现了酸、苦、涩、咸、鲜和甜味等基本味及回味的数字化评价，具有结果稳定且受外界影响小的优点。

取适量待测样品置于电子舌测试杯中，对其酸、甜、苦、涩、咸、鲜等基本味及回味进行测定，不同味觉与传感器一一对应，所有传感器分别在参比溶液和黄酒样品中浸泡、洗涤，测得电势值Vr和Vs，通过对Vs-Vr值的计算，即可对黄酒的酸、甜、苦、涩、咸和鲜味等基本味和回味进行分析。每个样品重复测试4～5次，为减少系统误差，选后3次纳入数据分析。

1.2.8 数据统计分析

每个试验重复3次，采用SPSS软件对数值进行差异显著性分析。

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